Un vistazo a nuestro día a día en la oficina de Memorias del IICSEstandarización de la técnica PCR-RFLP del gen mitocondrial cyt b como herramienta para la identificación de fuentes de alimentación de insectos hematófagos
Palabras clave:
PCR, RFLP, citocromo b, fuente de alimentación, leishmaniosisResumen
La identificación de la fuente de alimentación de insectos hematófagos puede proporcionar información sobre la capacidad vectorial, patrones de alimentación en condiciones naturales y proveer indirectamente datos sobre probables reservorios de enfermedades. Varias técnicas de identificación son empleadas, entre ellas las más utilizadas son las basadas en reacciones antígeno-anticuerpo. Actualmente, se han desarrollado ensayos moleculares, algunos de ellos permiten detectar e identificar solo sangre humana. Otros como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) del gen mitocondrial citocromo b (cyt b), que ha mostrado alto grado de sensibilidad y especificidad, permite detectar e identificar otras especies de vertebrados. El objetivo del trabajo fue estandarizar la técnica PCR-RFLP del gen mitocondrial citocromo b (cyt b) para determinar la fuente de alimentación sanguínea de insectos. Inicialmente se realizó un análisis bioinformático para la búsqueda y alineamiento de secuencias del gen cyt b de los potenciales huéspedes, con secuencias que están disponible en el GenBank. Se utilizaron 10 muestras de sangre de potenciales huéspedes vertebrados (humano, perro, gallina y roedor) y para la reacción de PCR se empleó un par de cebadores universales que amplifican una región del gen cyt b, seguido de cortes con dos enzimas de restricción (RFLP) (Hae III y Mwo I), generando patrones de electroforesis específicos para los diferentes vertebrados. Se logró la estandarización de la técnica de PCR del gen cyt b que fue capaz de detectar ADN de al menos 1 μL de sangre observándose el producto de amplificación de 358 pb. El análisis de los patrones de bandas obtenidos con el corte de las enzimas mostró los tamaños de fragmentos esperados para humano, gallina, perro y roedor. Estos resultados muestran la utilidad de la técnica PCR-RFLP del gen cyt b que, con un simple par de cebadores seguido del corte con dos enzimas de restricción, permitió diferenciar las diferentes especies de vertebrados de nuestro interés a través de los patrones obtenidos sin llegar a la secuenciación y también presenta la ventaja de utilizar pequeños volúmenes de sangre.
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Referencias
Che Lah EF, Ahamad M, Haron MS, Ming HT. Establishment of a molecular tool for blood meal identification in Malaysia. Asian Pac J Trop Biomed. 2012; 2(3): 223-227.
Haouas N, Pesson B, Boudabous R, Dedet J, Babba H, Ravel C. Development of a molecular tool for the identification of Leishmania reservoir hosts by blood meal analysis in the insect vectors. Am J Trop Med Hyg. 2007; 77(6): 1054-1059.
Pizarro JC, Lucero D, Stevens L. A method for the identification of guinea pig blood meal in the Chagas disease vector, Triatoma infestans. Kinetoplastide Biology and Dis 2007; 6(1):1-6.
Abbasi I, Cunio R, Warburg A. Identification of Blood Meals Imbibed by Phlebotomine Sand Flies Using Cytochrome b PCR and Reverse Line Blotting. Vector Borne Zoonotic Dis. 2009; 9(1): 79-86.
Ngo KA, Kramer LD. Identification of mosquito bloodmeals using polymerase chain reaction (PCR) with order-specific primers. J Med Entomol. 2003; 40(2): 215-22
Steuber S, Abdel-Rady A, Clausen P. PCR-RFLP analysis: a promising technique for host species identification of blood meals from tsetse flies (Diptera: Glossinidae). Parasitol Res. 2005; 97(3): 247-254.
Maleki-Ravasan N, Oshaghi M, Javadian E, Rassi Y, Sadraei J, Mohtarami F. Blood Meal Identification in Field-Captured Sand flies: Comparison of PCR-RFLP and ELISA Assays. Iran J Arthropod Borne Dis. 2009; 3(1):8-18.
Oshaghi MA, Chavshin AR, Vatandoost H. Analysis of mosquito bloodmeals using RFLP markers. Exp Parasitol. 2006; 114(4): 259-264.
Bosseno MF, Garcia LS, Baunaure F, Magallon- Gastelum E, Gutierrez MS, Kasten FL. Identification in triatomine vectors of feeding sources and Trypanosoma cruzi variants by Heteroduplex Assay and a Multiplex Miniexon Polymerase Chain Reaction. Am J Trop Med Hyg. 2006; (74): 303-305.
Mota J, Chacon JC, Gutierrez AF, Sánchez V, Wirtz A, Ordoñez R et al. Identificatioon of Blood Meal Source and Infection with Trypanosoma cruzi of Chagas Disease Vectors using a Multiplex Cytocrhrome b Polymerase Chain Reaction. Vector Borne and Zoonotic Diseases. 2007; 7 (4): 617-627.
Pizarro JC, Stevens L. A New Method for Forensic DNA Analysis of the Blood Meal in Chagas Disease Vectors demonstrated using Triatoma infestans form Chuquisaca, Bolivia. Plos One. 2008; 3 (10): e3585.
Chena L, Nara E, Oddone R, Canese A, Russomando G. Identificación de posibles reservorios silvestres de la leishmaniosis tegumentária empleando técnicas moleculares. VII Congreso Paraguayo de Infectologia. 2009 Nov 6-7; Asunción: Sociedad Paraguaya de Infectología; 2009.
Oddone R, Drechsel U, Chena L, Drechsel S, Acosta ME, Nara E. Roedores y marsupiales como posibles reservorios silvestres de Leishmania en Paraguay. I Jornada Paraguaya de Mastozoologia; 2013 Ago 1-3; Asunción: Sociedad de Mastozoologia del Paraguay; 2013.
Grimaldi G, Tesh RB and McMahon-Pratt D. A review of the geographic distribution and epidemiology of leishmaniasis in the world. Am J Trop Med Hyg. 1989; 41(6): 687-725.
Oliveira FS, Pirmez C, Pires MQ, Brazil RP, Pacheco RS. PCR-based diagnosis for detection of Leishmania in skin and blood of rodents from an endemic area of cutaneous and visceral leishmaniasis in Brazil. Vet Parasitol. 2005; 129(3-4): 219-227.
Sambrook J, Fritsch E, Maniatis T. Molecular cloning: A laboratory manual. New York : Cold Spring Harbor Laboratory Press; 1994.
Altschul SF, Madden TL, Schäffer AA, Zhang J, Zhang Z, Miller W, et al. Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. Nucleic Acids Res. 1997; 25(17): 3389-3402.
Bellagamba F, Moretti V, Comincini S, Valfre F. Identification of Species in Animal Feedstuffs by Polymerase Chain Reaction-Restriction Fragment Length Polymorphism Analysis of Mitochondrial. J Agric Food Chem. 2001; 49: 3775-3781.
