Introducción
Anaplasma
marginale es
una bacteria intraeritrocítica obligatoria, responsable de la anaplasmosis
bovina en animales domésticos y salvajes (Dumler et al., 2001; Rymaszewska &
Grenda, 2008; Kocan et al., 2010). La enfermedad está ampliamente distribuida a nivel mundial,
con una prevalencia significativa en regiones tropicales y subtropicales, donde
representa un serio problema económico y productivo para la ganadería en áreas
infestadas de garrapatas enzoóticas (Aubry & Geale, 2010). En Paraguay,
estudios anteriores mediante el diagnóstico con frotis sanguíneo revelan una
frecuencia de Anaplasma spp. en bovinos del 15%, 32% y 43%
respectivamente (Balbuena, 2021; Espinoza, 2018; Castro, 2019). Por su parte,
en Uruguay, Brasil y Bolivia evidencian una frecuencia de Anaplasma
marginale del 22,7%, 23% y 30,7% respectivamente. (Parodi et al., 2021; De
Souza Ramos et al., 2019; Ogata et al., 2021).
La
enfermedad se transmite por garrapatas mediante la transferencia mecánica de
sangre fresca del ganado infectado al ganado susceptible a través de moscas que
pican o por fómites contaminados con sangre, incluidas agujas, marcas en las
orejas, equipos de descornado y castración. En algunas regiones, la transmisión
transplacentaria de Anaplasma marginale puede contribuir a la
epidemiología de la anaplasmosis bovina (Wahba, 2017; Ben Said et al., 2018).
Tras
la infección, A. marginale invade y se multiplica en los eritrocitos
maduros. Durante la fase aguda de la enfermedad, la rickettsemia intraeritrocítica
puede alcanzar concentraciones de hasta 109 organismos por
mililitro de sangre, lo que provoca anemia hemolítica severa y una tasa de
mortalidad del 36% (Palmer et al., 2000). Los animales que sobreviven a la fase
aguda permanecen infectados de manera persistente, con ciclos fluctuantes de 102
– 107 organismos por ml de sangre (French et al., 1998). Esta
enfermedad genera pérdidas económicas significativas en las industrias de
producción lechera y ganadera de carne a nivel global (Kocan et al., 2003). Se
caracteriza por debilidad generalizada, pérdida de peso, fiebre, anemia severa,
palidez de las membranas mucosas, aborto, letargo, ictericia, disminución de la
producción de leche y, en muchos casos, la muerte de los animales afectados. En
países en desarrollo, donde puede haber recursos limitados para el control de
garrapatas y la atención veterinaria, la anaplasmosis bovina se convierte en un
problema importante. (Zim et al., 2024).
La
anaplasmosis bovina se puede detectar directa o indirectamente. Los métodos
indirectos evalúan los anticuerpos generados por el contacto previo con los
agentes. Las técnicas más comúnmente utilizadas son ELISA, inmunofluorescencia
indirecta y aglutinación (Goff et al.,2003; Organización Mundial de Sanidad
Animal, 2024). Estas técnicas son útiles para recopilar datos epidemiológicos
como la prevalencia de estos agentes en un rebaño; sin embargo, no pueden
utilizarse para la detección de enfermedades agudas. Los métodos directos se
basan en la visualización de los parásitos dentro de los eritrocitos en frotis
teñidos con Giemsa o en la detección del ADN mediante PCR (Parodi et al.,
2021). La baciloscopia es la técnica tradicional para la detección de A. marginale. Los parásitos
se encuentran fácilmente en los eritrocitos bovinos cuando los animales se
encuentran en la fase aguda de la infección (alta parasitemia). Sin embargo, la
técnica del frotis tiene menor sensibilidad para detectar animales portadores o
animales en las primeras etapas de la enfermedad. Además, la tinción utilizada
puede generar artefactos, dando resultados falsos positivos, y requiere
personal capacitado. Para superar estos problemas, las herramientas de biología
molecular como la PCR pueden ser útiles y tienen mayor sensibilidad y
especificidad (Brito et al., 2006).
Seis
proteínas de superficie principales (MSP) de A. marginale están bien
caracterizadas como msp1a, msp1b, msp2, msp3, msp4 y msp5. Estas proteínas
están implicadas en la respuesta inmune y la producción de anticuerpos en los
animales infectados (Tamekuni et al., 2009). El gen msp5 se caracteriza por su
alta sensibilidad y especificidad en el diagnóstico molecular mediante PCR, lo
que lo convierte en un marcador clave para la detección de infecciones
persistentes. (Torioni de Echaide et al., 1998). Estudios revelan que la
amplificación por PCR de los genes msp2 y msp5 tiene un nivel similar de
capacidad de detección, no así el gen msp1, que presenta una tasa de
positividad baja, la cual podría explicarse en parte por su intenso grado de
diversidad de secuencias (Arnuphapprasert et al., 2023).
En Paraguay, el ganado bovino
es de gran importancia económica para la industria ganadera. Actualmente en el país,
solo unos pocos estudios citológicos han investigado la prevalencia de Anaplasma
spp. en bovinos y ninguno específicamente Anaplasma marginale
mediante técnicas moleculares, por lo que faltan informes epidemiológicos
detallados que incluyen datos genéticos de este patógeno que circula en la
zona. Por lo tanto, este estudio tuvo como objetivo la detección y
caracterización molecular de esta bacteria en muestras de bovinos provenientes
de Paraguay.
Materiales y Métodos
Área de muestreo
El trabajo se llevó a cabo en
el Laboratorio de Biotecnología de la Facultad de Ciencias Veterinarias de la
Universidad Nacional de Asunción (UNA).
Material Biológico
Fueron
seleccionadas aleatoriamente 86 muestras del banco de ADN del Laboratorio de
Biotecnología, las mismas fueron procesadas previamente durante el primer
trimestre del año 2024 a partir de muestras de sangre entera bovina de aptitud
de carne y leche que fueron remitidas al laboratorio con el proposito de ser
analizadas por la tecnica de PCR convencional para la deteccion de diversos
hemopatogenos. Las mismas fueron extraídas mediante el kit comercial GeneJET
(Thermo Fisher Scientific), siguiendo las instrucciones del fabricante,
obteniendo 50μL de ADN purificado. Posterior a su extracción fueron conservadas
a -20 °C hasta su procesamiento. Se utilizó el NanoDrop ND-1000 para
cuantificar las 86 muestras evaluadas por triplicado y se determinó el valor
promedio de la concentración y pureza del ADN de cada una de las muestras. Se
trabajo con muestras de ADN con una concentración promedio de 20 a 90 ng/μL.
PCR convencional (c) para la detección de Anaplasma marginale
Las muestras se
procesaron mediante la técnica de PCR convencional utilizando los
cebadores msp5F 5 ́GTGTTCGTTGGGGTGTGATAGATGAG3 ́y msp5R 5 ́TAAGAATTAAGCATGTGACCGCTGAC3 ́, que delimitan todos los genes msp5 de A. marginale, y
una región no traducida de 3', según Silva et al. (2006), para amplificar
una región de 653 pares de bases. Como control positivo se utilizó ADN de un
bovino naturalmente infectado previamente
secuenciado, y como control negativo, agua ultrapura libre
de nucleasas y ADN extraído de muestra de sangre
de bovino que resultó negativo para A. marginale en frotis sanguíneo. La mezcla de reacción estuvo compuesta por 5 μL de GoTaq®
Master Mix (Promega Corporation, Madison, WI, EE.UU.) 200 nM de cada cebador
externo (y), 2 μL de ADN molde y agua libre de nucleasas hasta completar un
volumen total de 10 μL. El programa de amplificación utilizado fue: un ciclo
de 94°C por 1 minuto; 30 ciclos de 94°C por 1 minuto, 53°C por 1 minuto, 72°C por 1 minuto; y la extensión
final de 72°C por 10 minutos descrito por Corona y Martínez (2011). Todos los
reactivos se manipularon en condiciones de flujo laminar, utilizando puntas con
filtros (Eppendorf®; BioPointe Scientific, Mettler Toledo Rainin, EE.UU.).
Electroforesis
Los resultados se
visualizaron en geles de agarosa al 1,5% (Agarose Gel Electrophoresis Kit
-MB570) de HiMedia (HiMedia Laboratories, India) mediante electroforesis en
cámara y fuente (Bio-Rad, modelo V500/150) durante una hora. Para la
visualización del ADN, los geles se tiñeron con bromuro de etidio (0,5 mg/mL)
en TAE 1X durante 40 minutos y se observaron en un transiluminador de luz
ultravioleta UVP Inc. Digi Doc-It
Darkroom (P/N 76-0311-01) con Drawer Assembly (P/N 98-0068-01). La extracción de ADN, amplificación por cPCR y electroforesis
se realizaron en tres salas separadas para evitar la contaminación cruzada.
Secuenciamiento y
análisis filogenético
Para confirmar los
productos obtenidos mediante cPCR, se seleccionaron aleatoriamente tres muestras
positivas, que fueron enviadas a Macrogen (Corea del Sur) para su purificación
y posterior secuenciación mediante el método Sanger. Las secuencias forward
y reverse se analizaron en el programa MEGA 11 para obtener secuencias
consenso. El porcentaje de identidad se determinó utilizando la herramienta
BLASTn (Altschul et al., 1990). El
análisis filogenético se realizó mediante Maximum likelihood, utilizando
el modelo de sustitución de máxima verosimilitud determinada en el software
MEGA 11 (Kumar et al., 2018), se estimó mediante un análisis bootstrap con 1000
réplicas.
Números de
acceso al Genbank para secuencias de nucleótidos de Anaplasma marginale
Los números de acceso de las
secuencias de nucleótidos utilizadas para la comparación se indicaron junto al
nombre del organismo en la Figura 2. Se incluyó la secuencia de Bartonella henselae (AM294984) para
representar el grupo externo. Las secuencias de
nucleótidos obtenidas en este estudio fueron registradas en GenBank con los
siguientes números de acceso: genes msp5 de A. marginale (PQ815167, PQ815168 y PQ815166).
Resultados
En la evaluación por cPCR de muestras de ADN
basadas en el gen msp5, el 35% (30/86) de las muestras de bovinos resultaron
positivas para infección por A. marginale. Todas las muestras positivas
mostraron el producto de PCR esperado de 653 pares de bases. (Figura 1)
Figura 1. Resultado de electroforesis en gel de
agarosa al 1,5% de productos de amplificación de la cPCR, utilizando cebadores
del gen msp5 específicos para A. marginale. 1: marcador de peso
molecular de 100 pb; C-: control negativo; pocillo 3,4,7,11,12,14 y 16: muestras
positivas a A. marginale; C+: control positivo que corresponde a un
tamaño de 653 pb.
Para confirmar los resultados de
la cPCR, se secuenciaron tres productos de PCR positivos. Un análisis BLAST de
las secuencias obtenidas mostró una identidad significativa (99 – 100%) con
secuencias de A. marginale reportadas en Tailandia (ON456122, ON456120),
China (F546443), Benín (ON456120), Nigeria (ON227469) y Sri Lanka (LC467687).
El análisis de distancia (Figura 2) utilizando el software MEGA 11 con el
método Maximum Composite Likelihood reveló tres
clados bien definidos de secuencias de A. marginale. Las tres secuencias
msp5 detectadas en ganado vacuno de Paraguay se agruparon con secuencias de
Tailandia, China, Benín, Nigeria y Sri Lanka. Otro clado incluyó secuencias de
Jabotical, Palmeira, Florida y St. Maries, mientras que el tercer clado
comprendió aislados de Str. Dawm, Palmeira, Brasil, Uruguay, Italia,
Tamaulipas, Jabotical, Colombia y Argentina (Figura 2).
Figura 2. Árbol filogenético basado en
las secuencias del gen msp5 de las
especies de Anaplasma. El árbol filogenético se construyó
utilizando MEGA11 basado en el método del vecino más cercano, utilizando el modelo
de sustitución de máxima verosimilitud compuesta. Las secuencias obtenidas en
este estudio se muestran al lado del nombre del país señaladas mediante una
llave.
Discusión
De las 86 muestras examinadas, se
identificaron bandas de ADN de Anaplasma marginale en las muestras de 30
(35%) bovinos. Se han reportado en el pais prevalencia de Anaplasma spp.
en bovinos que presentan una variación, entre 15% a 43%, basado en
diagnóstico citológico (Balbuena,
2021; Espinoza, 2018; Castro 2019).
Si bien el resultado obtenido en este trabajo es similar a los previamente
referenciados, es importante destacar que dichos estudios mencionan la
presencia del patógeno de manera genérica, a diferencia de este trabajo en
donde se demuestra la circulación de Anaplasma marginale mediante su
detección molecular. Estudios previos indican que en la lectura de frotis se observan
inconvenientes para diferenciar especies de Anaplasma cuando hay formas
inmaduras presentes, lo que requiere personal capacitado para una detección
precisa. Así como la sensibilidad de la lectura de frotis se reduce cuando las
muestras no son óptimas. (Canever et al., 2014; Parodi et al., 2021). Para
superar estos problemas, las herramientas de biología molecular como la PCR
pueden ser útiles y tienen mayor sensibilidad y especificidad. (Brito et al.,
2006)
El porcentaje de A.marginale
detectado en el ADN de bovinos podría explicarse por el hecho de que las
garrapatas son vectores biológicos bien conocidos de Anaplasma spp A
nivel mundial, se ha documentado que aproximadamente 20 especies de garrapatas
son vectores biológicos de estas bacterias. Las garrapatas reportadas en
Paraguay, pueden clasificarse como “endémicas o establecidas”, Ixodes
loricatus, Rhipicephalus microplus y Rh. sanguineus. La mayoría de
las recolecciones de garrapatas paraguayas se han realizado en el dominio fitogeográfico
del Chaco, en la parte central del país. Argas persicus o una especie
relacionada, Am. cajennense, D. nitens, Rh. microplus y Rh.
sanguineus son parásitos importantes de los animales domésticos. Lo que
respecta a Rhipicephalus microplus es más común en la Región Oriental y
se encuentra ampliamente en el ganado bovino en Paraguay; por lo tanto,
probablemente esté establecido en todos los dominios amazónicos y chaqueños
(Nava et al., 2007) Además de estos, existen otros medios mecánicos de
transmisión, como fómites contaminados, agujas, descornes, pinzas nasales,
dispositivos para marcar las orejas, instrumentos de castración y dípteros
chupadores de sangre de los géneros Tabanus, Stomoxys y varias especies
de mosquitos que actúan como jeringas biológicas (Kocan et al., 2010). Estos
tipos de transmisión están ampliamente distribuidos y son comunes en la
práctica ganadera del Paraguay, lo que se correlaciona fuertemente con el alto
porcentaje de infección por A. marginale en el ganado bovino.
La amplificación del ADN del patógeno
mediante PCR tiene ventajas claras sobre otros métodos para la detección en
animales persistentemente infectados con A. marginale, ya que esta
bacteria puede ser difícil de detectar mediante técnicas convencionales como exámenes
microscópicos (Melman et al., 2004) cuando los niveles de parasitemia son
bajos. Herrero et al. (1998), demostraron que la PCR puede identificar estos
bajos niveles de parasitemia en animales persistentes, algo que no es posible
con los métodos diagnósticos tradicionales.
La selección del gen msp5 para la
detección de A. marginale se basa en estudios previos que han demostrado
que las proteínas MSP de estas bacterias son fundamentales en las interacciones
del parásito con sus hospedadores vertebrados y sus vectores. Msp5 también
se ha utilizado como diana para detectar A. marginale en ganado vacuno
en muestras de campo y, con mayor frecuencia, en muestras experimentales (Futse
et al., 2003). Msp5 está muy conservado entre las cepas de A.
marginale y es un gen de copia única, por lo que ofrece algunas ventajas
como diana para garantizar la detección de cepas ampliamente variantes de A.
marginale (Organización Mundial de Sanidad Animal, 2024). Estos genes evolucionan más
rápidamente que otros debido a la presión selectiva de los sistemas
inmunológicos de hospedadores diferentes presentes en el ciclo de
transmisión (de la Fuente et al., 2005; Kocan et al., 2003; Kocan et al., 2004;
Brayton et al.,
2005). El uso del gen msp5 proporciona una herramienta diagnóstica sensible y
específica para detectar A. marginale en animales, independientemente de
la presencia de síntomas clínicos, para lo cual es crucial tanto para la importación
como la exportación de ganado (Corona & Martinez, 2011).
Las secuencias del gen msp5
detectadas en este estudio se agruparon con las reportadas en muestras de
ganado de Tailandia, China, Benín, Nigeria y Sri Lanka, formaron un
grupo distinto al de los bovinos de América del Norte y Sudamérica. Estos
hallazgos muestran un alto grado de similitud genética con secuencias de
diversos países de Asia y África. Un patrón similar fue reportado por
Arnuphapprasert et al. (2023), quienes observaron que las secuencias de A.
marginale msp5 de Tailandia, China, Brasil, México, Benín, Japón, Kenia y
Sri Lanka se agrupaban en un clado específico. Estos resultados podrían
explicarse mediante lo evidenciado por Kocan et al., (2010), en donde explican
que se han identificado varias cepas de A. marginale en diversas
regiones geográficas. Exhiben diferencias morfológicas, secuencias de proteínas
únicas, características antigénicas variadas y capacidades de transmisión
variables a través de las picaduras de garrapatas. La interacción entre A. marginale
y las células huésped depende en gran medida de sus principales proteínas de
superficie, que determinan su capacidad para causar enfermedades. Se
identificaron seis MSP en A. marginale, derivadas de eritrocitos bovinos
(Barbet et al., 2000). Se descubrió que estaban conservados en organismos
derivados de cultivos celulares y garrapatas (Kocan et al., 2003 & Kocan et
al., 2004). De estas MSP, MSP1a, MSP4 y MSP5 provienen de genes únicos y no
varían antigénicamente dentro de las cepas. Sin embargo, MSP1b, MSP2 y MSP3
pertenecen a familias multigénicas y pueden variar antigénicamente,
particularmente en ganado infectado persistentemente (Kocan et al., 2003, Kocan
et al., 2010 y de la Fuente et al., 2005). Estudios recientes han sugerido que
los diferentes genotipos de A. marginale dentro de rebaños en un área
endémica pueden explicarse por eventos de transmisión independientes a través
de movimientos de ganado infectado, en lugar de movimientos de garrapatas
(Kocan et al., 2004; de la Fuente & Kocan, 2000).
La anaplasmosis bovina es una causa
importante de morbilidad y mortalidad en el ganado, particularmente en el
ganado mestizo en regiones tropicales y subtropicales. La distribución
geográfica de la enfermedad depende de la densidad y distribución de las
garrapatas vectores y huéspedes reservorios. La distribución de la anaplasmosis
puede seguir cambiando debido al calentamiento global, que puede afectar el
movimiento del huésped de la garrapata (de Souza Ramos et al., 2019).
Finalmente
es importante acotar, que actualmente existen limitaciones en cuanto al control
y prevención de A. marginale, ya que las vacunas desarrolladas hasta la
fecha no son altamente efectivas. Igualmente, el tratamiento con antibióticos
no ha sido eficaz en varias granjas, ya que los animales tratados suelen volver
a infectarse. Además, los antibióticos también presentan un mayor costo para el
agricultor (da Silva et al., 2016). La insuficiente sensibilidad y
especificidad de los ensayos de diagnóstico de Anaplasma spp., el potencial
de reacción cruzada entre especies de este género y la necesidad de determinar
el estado de infección de los animales han llevado al desarrollo de ensayos de
PCR para el diagnóstico de Anaplasma marginale. Sin olvidar que el
control de la anaplasmosis, necesita de métodos de diagnóstico que permitan
conocer la prevalencia del microorganismo en las diferentes zonas de los países
tropicales y subtropicales, además que permitan identificar de forma segura
los animales portadores para el movimiento de animales a zonas libres del hemoparásito
(Camacho-Nuez et al., 2000).
Conclusión
Este
estudio representa el primer reporte de la detección molecular de Anaplasma
marginale a partir de ADN sanguíneo de bovinos en Paraguay. Sin
embargo, se requieren más investigaciones para profundizar en la patogenicidad,
distribución geográfica y los ciclos de transmisión de esta bacteria, así como
la amplificación de otros genes que permita una mejor clasificación
filogenética de las cepas detectadas.
Agradecimientos: Al programa
SISNI (Sistema Nacional de Investigadores), del Consejo Nacional de Ciencias y
Tecnología (Conacyt) del Paraguay.
Contribución de autores: Conceptualización: O.L.N.Y., Curación de datos: O.L.N.Y., L.C.R.A.;
Análisis formal: O.L.N.Y., L.C.R.A.;
Adquisición de fondos: O.L.N.Y., G.G.B.
;Investigación: O.L.N.Y., L.C.R.A..;
Metodología: O.L.N.Y., A.M.A.O., M.L.Q.N.;
Administración del Proyecto: O.L.N.Y; Recursos:
O.L.N.Y., G.G.B. ; Software: O.L.N.Y., L.C.R.A. ; Supervisión: O.L.N.Y., L.C.R.A.; Validación: O.L.N.Y., L.C.R.A. ; Visualización: O.L.N.Y., L.C.R.A.; Redacción-borrador original: O.L.N.Y; Redacción-revisión y edición: O.L.N.Y., I.P.F.I., M.L.Q.N.
Fuente de Financiamiento: Sin fuente de financiamiento.
Disponibilidad
de datos: Los
datos utilizados en esta investigación podrán ser solicitados al autor de
correspondencia según pertinencia: Lorena Núñez, correo electrónico:
lnunez@vet.una.py
Proceso
de revisión: Este artículo fue evaluado mediante un proceso
de revisión por pares doble ciego.
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, Universidad Nacional de Asunción
(UNA). Facultad de Ciencias Veterinarias (FCV). San Lorenzo, Paraguay.
, María de Lourdes Narváez Quiñónez1