Introducción
Actualmente, la tenencia de animales de compañía se ha
incrementado considerablemente, debido a que ofrecen múltiples beneficios para
los integrantes de una familia, tales como reducir la sensación de soledad.
Además, genera obligaciones con las que se aprende a tener responsabilidad,
proveen diversión, entretenimiento y representan una compañía incondicional.
Los animales domésticos como perros y gatos representan el origen de
enfermedades zoonóticas más cercanas en zonas urbanas (Peña et al., 2017). Debido
a la convivencia y relación que existen entre dichos animales con el ser
humano, los microorganismos en sangre generan implicaciones leves a mortales en
la salud humana, principalmente a personas con sistemas inmunológicos inmaduros
(Kolo et al., 2016).
Mascotas con enfermedades hematológicas se presentan
constantemente en las clínicas veterinarias debido al deterioro en la salud de
los animales (Yongjin et al., 2018). Comúnmente, las alteraciones son
producidas por microorganismos trasmitidos por vectores (biológicos y
mecánicos), especialmente en zonas tropicales y subtropicales, siendo muchos de
estos microorganismos capaces de afectar a los animales domésticos y al ser
humano (Salim et al., 2019).
A pesar de los enormes
esfuerzos del hombre por eliminar a los parásitos de sus mascotas, estos
continúan siendo un grave problema de salud en países desarrollados (Matos et al., 2015) y este impacto es
mucho más notorio en países en vías de desarrollo (Encalada-Mena et al.,
2011).
En términos biológicos un “vector” es todo organismo vivo con la
capacidad de transportar (movilizar) y transmitir de forma activa y constante
cualquier microorganismo desde un hospedero vertebrado e infectado hacia otro
susceptible. Este proceso, que se define como “transmisión biológica” (Tercero
Gutierrez y Olalla Herbosa, 2008) puede ocurrir desde personas hacia animales o
desde animales hacia personas (OMS, 2017). Los distintos agentes patógenos
(parásitos, virus o bacterias), transmitidos por vectores, necesitan
multiplicarse o generar sus formas infectivas fuera o dentro de las células de
los hospederos para completar su ciclo de vida. De esta manera, los patógenos
son transmitidos hacia otro hospedero susceptible por alguno de los mecanismos
mencionados posteriormente (Tercero Gutierrez y Olalla Herbosa, 2008).
El estrecho contacto entre
humanos y animales domésticos, pone de relieve la importancia en el seguimiento
que se haga de la salud animal, tanto por el valor afectivo respecto de las
mascotas y su estado de salud, como por la posibilidad de constituirse en
reservorios de entidades zoonóticas o ser hospederos de vectores con la
capacidad de transmitir estas enfermedades, las cuales pueden ser
diagnosticadas mediante extendidos sanguíneos y/o confirmadas mediante pruebas
serológicas más específicas y sensibles o mediante técnicas moleculares como
PCR (Costa
Oliveira, 2010; Cordero del Campillo y Rojo Vázquez, 2000).
Los resultados de estudios basados en este tema, además de generar
conciencia sobre la presencia de los hemoparásitos y microorganismo en los
animales, evitará problemas subsecuentes que puedan afectar la salud general
del animal, ya que los hábitos culturales y la forma que las personas actúan
frente a las enfermedades muchas veces, no es la correcta favoreciendo de este
modo la transmisión de agentes patógenos, así como su permanencia en las zonas
de riesgo (Oscherov
et al., 2008).
Teniendo en cuenta la
importancia de la investigación, el propósito de esta investigación fue estimar
los casos positivos de Ehrlichia spp., Anaplasma platys y Leishmania
spp., en perros, tomando en cuenta sexo, raza, edad y tipo de muestras
diagnosticados en el laboratorio de biotecnología de la FCV - UNA (primer
semestre del año 2021).
Materiales y métodos
El trabajo fue
realizado en la División de Laboratorio de Biotecnología del Departamento de
Clínicas Veterinarias de la Facultad de Ciencias Veterinarias de la Universidad
Nacional de Asunción, San Lorenzo, Paraguay, se recibieron y analizaron
muestras de sangre entera, suero sanguíneo y aspirado medular provenientes
tanto del Hospital Veterinario "Prof. Dr. José Vicente Núñez", así
como de clínicas veterinarias externas a la institución.
Diseño y criterios del
trabajo:
La investigación
corresponde a un estudio de tipo descriptivo y retrospectivo.
Fueron seleccionados 300 registros de resultados de animales de la
especie canina, sin distinción de raza, sexo y edad procedentes del área
metropolitana de Asunción, los cuales fueron procesados durante el primer
semestre del año 2021 empleando la técnica cPCR o reacción en cadena de la
polimerasa convencional para la detección de los hemoparásitos Ehrlichia spp.
y Anaplasma platys a partir de sangre entera y Leishmania
spp. en sangre entera y aspirado medular; además, fueron analizadas muestras de
suero sanguíneo para la detección de anticuerpos para Leishmania spp. y Ehrlichia
spp. utilizando el test inmunocromatográfico. El tipo de muestra enviada, el
microorganismo a ser identificado y la técnica empleada, varió según el
criterio del médico veterinario solicitante.
Para la detección de los hemoparásitos por cPCR, el material
genético fue extraído a partir de sangre entera o aspirado medular empleando el
kit de extracción comercial basado en columnas de sílica Thermo
Scientific™ GeneJET Viral DNA/RNA Purification Kit, siguiendo el protocolo
indicado por el fabricante.
Las muestras de ADN obtenidas fueron sometidas a un protocolo
convencional para la identificación de una región conservada del gen 18S para Ehrlichia
spp., gen p44 de Anaplasma platys y k-ADN para la amplificación
de Leishmania spp., descritas por (Murphy et al., 1998),
(Breitschwerdt et al., 2014) y (Michalsky
et al. 2002), respectivamente.
Todos los productos fueron sometidos a electroforesis en gel de
agarosa (SeaKem®LE Agarose, Lonza) al 2 %, teñido con bromuro de etidio. Por
último, los geles fueron observados en un transluminador (JY-025 UV
Transluminator) con luz ultravioleta.
Se recibieron muestras de suero sanguíneo con el propósito de
analizarlas mediante inmunocromatografía para la identificación rápida de
anticuerpos para Leishmania spp. o Ehrlichia spp. Fueron
utilizados los kits comerciales Anigen Rapid Leishmania Ab Test Kit
y E. canis Ab rapid test para la detección cualitativa de
anticuerpos para Leishmania spp. y Ehrlichia spp.
respectivamente.
Finalmente,
los resultados fueron tabulados en una hoja de cálculo Excel y evaluados
estadísticamente a través del software R. Las variables analizadas fueron raza,
sexo, edad (meses), hemopatógeno identificado, muestra biológica y técnica
laboratorial empleada para la determinación de los microorganismos.
Resultados
En la tabla 1, se exponen los resultados de casos positivos para Anaplasma
platys, Leishmania spp. y Ehrlichia spp., empleando dos
herramientas de diagnóstico: cPCR e inmunocromatografía. Es importante destacar
que la elección de la técnica de diagnóstico empleada en cada caso particular
dependió del médico veterinario solicitante. Esto significa que, algunos casos fueron
analizados mediante cPCR mientras que otros por medio de inmunocromatografía.
La variación en las
técnicas de diagnóstico empleadas, responde a que diferentes médicos
veterinarios pueden tener preferencias o consideraciones específicas en función
de la situación clínica de cada paciente o bien la disponibilidad de recursos
del propietario en el momento del diagnóstico.
Tabla 1. Cantidad de
resultados positivos a los principales hemopatógenos identificados en el
Laboratorio de Biotecnología mediante cPCR o inmunocromatografía.
|
Técnica de Diagnóstico
|
Leishmania spp.
|
Ehrlichia spp.
|
Anaplasma Platys
|
|
cPCR
|
20
|
25
|
0
|
|
Inmunocromatografía
|
19
|
2
|
0
|
|
Total
|
39
|
27
|
0
|
De forma más específica,
los casos positivos hallados empleando la técnica cPCR o inmunocromatografía
según el sexo fueron: 35 hembras positivas de las 300 muestras analizadas (12 %
del total), hallándose 0 positivas a Anaplasma platys, 17 muestras
positivas a Ehrlichia spp. y 18 a Leishmania spp.; en lo que
respecta a resultados negativos, 119 hembras fueron negativas (40 % del total).
En machos, fueron identificadas 31 muestras positivas de las 300 analizadas (10
% del total), 0 positivas a Anaplasma platys, 10 muestras positivas a Ehrlichia
spp. y 21 a Leishmania spp. sin embargo, los resultados negativos en
machos fueron 2 a Anaplasma platys, 17 a Ehrlichia spp. y 96 a Leishmania
spp. (38 % del total).
Tabla 2. Casos positivos de los principales hemopatógenos
identificados en el Laboratorio de Biotecnología durante el primer semestre del
2021, clasificados según el sexo de los animales positivos y negativos.
|
Microorganismo
|
RESULTADO
|
TOTAL
|
|
POSITIVO
|
NEGATIVO
|
|
Hembra
|
Macho
|
Hembra
|
Macho
|
|
|
Anaplasma platys
|
0
|
0
|
0
|
2
|
2
|
|
Ehrlichia
spp.
|
17
|
10
|
16
|
17
|
60
|
|
Leishmania
spp.
|
18
|
21
|
103
|
96
|
238
|
|
Total
|
35
|
31
|
119
|
115
|
300
|
|
FR
|
12 %
|
10 %
|
40 %
|
38 %
|
100 %
|
Figura
1.
Detección de microorganismos mediante dos técnicas laboratoriales, PCR e
inmunocromatografía.
En relación al tipo de microorganismo, se registraron muestras
positivas a Leishmania spp. del 13 %, Ehrlichia spp. del 9 % y Anaplasma
platys del 0 %. Del total de las muestras analizadas, la solicitud de los
clínicos veterinarios para la detección Leishmania spp., Ehrlichia
spp. y Anaplasma platys mediante cPCR fue de 29,3 % 18,6 % y 0,66 %, más
para la detección de estos microorganismos por inmunocromatografía fue del 50
%, 1,3 % y 0 % respectivamente (Figura 1).
Figura 2. Resultados
obtenidos según muestras biológicas analizadas por PCR o inmunocromatografía.
En cuanto a las muestras biológicas analizadas, empleando cPCR o
inmunocromatografía indistintamente, los casos positivos registrados fueron
mayoritariamente a través de sangre entera 15 %, seguida por suero sanguíneo 6
% y finalmente aspirado medular 3 %; en cambio, los resultados negativos
correspondieron al 35,6 %, 40,6 % y 1,66 % para tales muestras, como se
visualiza en la Figura 2.
Figura 3. Casos
positivos de los principales hemopatógenos identificados en el Laboratorio de
Biotecnología durante el primer semestre del 2021, clasificados por grupo
etario de los perros.
Según la Figura 3,
los casos positivos a Ehrlichia spp. identificados por cPCR o
inmunocromatografía teniendo en cuenta el rango etario, fue equivalente tanto
en cachorros como en gerontes 2,6 % y para adultos del 3,6 %; en lo que
respecta a Leishmania spp., fue, para los gerontes 2,6 %, adultos del
8,6 %, y cachorros 1,6%. Los perros fueron clasificados de acuerdo al rango etario como
adultos (13 a 84 meses), cachorros (0-12 meses) y gerontes (mayores de 84
meses), comprendiendo 56 %, 24 % y 20 % de los positivos respectivamente.
Tabla 3. Detección de
hemopatógenos de acuerdo a razas caninas, analizadas en el Laboratorio de
Biotecnología durante el primer semestre del 2021.
|
Raza
|
Microorganismo detectado
|
|
Leishmania spp.
|
Ehrlichia spp.
|
|
|
N=
|
%
|
N=
|
%
|
|
Beagle
|
1
|
0,3
|
0
|
0
|
|
Caniche
|
3
|
1
|
3
|
1
|
|
Chow
chow
|
1
|
0,3
|
0
|
0
|
|
Fila
brasilero
|
1
|
0,3
|
0
|
0
|
|
Labrador
retriever
|
3
|
1
|
1
|
0,3
|
|
Mestiza
|
28
|
9,3
|
15
|
5
|
|
Pastor
alemán
|
1
|
0,3
|
0
|
0
|
|
Pinscher
|
0
|
0
|
1
|
0,3
|
|
Pit
bull
|
0
|
0
|
4
|
1,3
|
|
Rottweiler
|
1
|
0,3
|
0
|
0
|
|
Shar
pei
|
0
|
0
|
1
|
0,3
Cont.
Tabla 3
|
|
Cont.
Tabla 3
|
|
|
|
|
|
Teckel
|
0
|
0
|
1
|
0,3
|
|
Total
|
39
|
12,8
|
25
|
8,5
|
Fueron registradas
27 razas de perros, de las cuales 12 de ellas fueron positivas para al menos un
microorganismo, donde los porcentajes se especifican en el Tabla 3.
Discusión
En los últimos años, los casos confirmados de hemopatógenos en
perros han aumentado a nivel mundial; esto responde, en parte, por la falta de
control de vectores, cambio climático, resistencia a los medicamentos, además
del desarrollo de nuevos métodos de diagnóstico (Reithinger & Dujardin, 2006).
Se ha determinado que la presencia de aparición de hemopatógenos
según sexo, fue mayor en hembras que en machos, esto discrepa con lo descrito
por (Suh et al., 2017) el cual identificó mayor cantidad de casos positivos a enfermedades
transmitidas por vectores en caninos machos; sin embargo, de acuerdo a (Luiz et al., 2019 y Dantas-Torres, 2008) no existe relación
determinante entre el sexo del perro y la presentación de hemopatógenos, por
tanto, es posible que la infección se presente de manera indiscriminada en
ambos sexos.
Basados en la clasificación etaria elaborada por (Echeverri-De la Hoz, et
al., 2022); la mayor cantidad de casos positivos identificados de
hemopatógenos según rango etario ha sido en adultos, tanto para Leishmania
spp. como Ehrlichia spp. Este hallazgo coincide con lo descrito por (Paternina
Tuiran et al., 2015) los cuales describieron una mayor frecuencia de anticuerpos para Leishmania
spp. en jóvenes y adultos (12 a 60 meses) y con (Cusicanqui y Zúñiga, 2020),
donde registraron mayor presencia de anticuerpos para Ehrlichia spp. en
perros adultos. Estos resultados podrían responder a que los dueños tienden a
dejar fuera del hogar a sus canes una vez que éstos alcanzan la edad adulta,
predisponiendo la exposición a vectores transmisores de hemopatógenos.
La relación entre la raza mestiza y la presencia de hemopatógenos
hallada en este estudio (9,3 % para Leishmania spp. y 5 % para Ehrlichia
spp.) coincide con lo descrito por (González-Britez et al., 2021) y (Cartagena Yarce, 2014)
quienes también identificaron elevada frecuencia de Leishmania spp. y Ehrlichia
spp. respectivamente en la raza mestiza; asimismo, la raza con mayor cantidad
de resultados negativos también fue la mestiza (104/300). Esto podría deberse a
que, tanto en este estudio como en los dos mencionados con anterioridad,
existían mayor cantidad de individuos mestizos analizados que de otras razas
(162/300), es probable que esto se deba a que la adopción de perros mestizos es
relativamente más accesible para la mayoría de las personas.
En cuanto a las muestras biológicas analizadas y los resultados
obtenidos a partir de las mismas, la sangre entera ha dado mayor cantidad de
resultados positivos (45/300), esto responde a que, la extracción y manejo de
este fluido es relativamente más sencilla que aspirado medular y suero
sanguíneo para su posterior análisis por cPCR, técnica que permite identificar
tanto Leishmania spp., Ehrlichia spp. y Anaplasma platys a
partir de dicha muestra; para la extracción de médula ósea, se precisa de
experiencia y buen manejo del paciente por parte del operario, asimismo para
suero sanguíneo, ya que se requiere conocimientos para la obtener una correcta
separación entre los componentes celulares de la sangre y suero para obtener
resultados confiables. Según
(Pedrosa Amado, 1999), la PCR es una herramienta de diagnóstico que se destaca
por su gran sensibilidad y especificidad, ya que “solo las secuencias de ADN
que se amplifican, son aquellas que se encuentran entre los dos fragmentos
iniciadores que han hibridado”, siendo poco probable que se presenten falsos
positivos o reacciones cruzadas con otros microorganismos.
Los
resultados de este estudio indican que, comparando la técnica de detección
rápida de anticuerpos o inmunocromatografía con la cPCR, la primera de ellas ha
exhibido mayor cantidad de positivos para Leishmania spp., es posible
que esto se deba a que existió mayor demanda de ésta técnica por parte de los
médicos veterinarios solicitantes, ya que es una prueba rápida, económica y
sencilla en comparación a la cPCR, sin embargo, carece de elevados porcentajes
de especificidad y sensibilidad debido a que detecta los anticuerpos producidos
por el sistema inmunológico luego de la primoinfección y no la presencia del
microorganismo en el suero sanguíneo. Según (Rodriguez y Irlene, 2009) los caninos, sean
sintomáticos o no, desarrollan una respuesta específica a Leishmania
spp., sin embargo, se ha demostrado que la producción de anticuerpos por el
animal infectado presenta un patrón antigénico similar a uno sano, por lo que
los resultados que se pueden obtener a través de esta técnica pueden
considerarse ambiguos.
Conclusiones
De
acuerdo a los resultados obtenidos, se determinó la presencia de tres
hemopatógenos en perros, detectados en la División Laboratorio de Biotecnología
de la Facultad de Ciencias Veterinarias, UNA, siendo Leishmania spp. (13
%) la especie diagnosticada con más frecuencia, seguido de Ehrlichia
spp. (9 %) entre los animales positivos y para Anaplasma platys (0 %);
de igual manera es importante mencionar el uso de técnicas moleculares como la
cPCR que ofrece mayor especificidad a la hora de dar resultados verdaderamente
positivos y constituir una opción a las técnicas tradicionales de diagnóstico,
confirmando la importancia de establecer programas de monitoreo y vigilancia
epidemiológica en animales de compañía de manera a evaluar periódicamente las
tendencias y establecer medidas para controlar la dinámica de comportamiento de
los hemopatógenos, en beneficio de la calidad de vida de las mascotas y la
salud pública. Respecto a las futuras investigaciones, se sugiere ampliar el
número de individuos analizados, obtener aspectos clínicos relevantes y datos
demográficos más específicos de los casos positivos, además de comparar la
sensibilidad y especificidad de las técnicas empleadas.
Fuente
de Financiamiento
Sin financiamiento externo.
Contribución
de autores
Concepción del estudio: I.P.F.I., O.L.N.Y. Diseño
del experimento: I.P.F.I., O.L.N.Y. Ejecución del experimento: I.P.F.I.,
G.G.B., O.L.N.Y. Verificación del experimento: A.M.A.O., G.G.B. Análisis/interpretación
de datos: I.P.F.I., O.L.N.Y. Análisis estadísticos: M.I.R.A. Preparación
del manuscrito: I.P.F.I., A.M.A.O., M.L.Q.N., O.L.N.Y. . Edición y
revisión del manuscrito: A.M.A.O., G.G.B., M.L.Q.N. Aprobación de la
versión final del manuscrito: I.P.F.I, A.M.A.O.,G.G.B.,M.L.Q.N., M.I.R.A.,
O.L.N.Y.
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988–995. doi: 10.1016/j.ttbdis.2018.03.025.
,
Universidad Nacional de Asunción.
, María Inés Rodríguez Acosta1
